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在大椎与肩峰连线中点，肩部筋肉处。
坐位。先确定大椎穴与肩峰最高点（肩部最高骨）的位置，再取两者连线的中点，在两筋之间，按压有明显酸胀感处即为此穴。
有斜方肌、肩胛提肌；浅层布有锁骨上神经及颈浅动、静脉的分支或属支；深层有颈横动、静脉或属支和肩胛背神经的分支。
肩井穴配足三里穴、阳陵泉穴治脚气酸痛；治疗特效穴。
肩井穴配肩髃穴、天宗穴，有活血通络止痛的作用，主治肩背痹痛。
肩井穴配乳根穴、少泽穴，有消炎通乳止痛的作用，主治乳汁不足，乳痈。
肩井穴配合谷穴，三阴交穴，有活血利气催胎的作用，主治。
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