cGAS-STING通路的发现之旅
自上次稍稍搜索了一番HBV和STING之间的关联，我突然对这条通路很感兴趣，业余的时间总忍不住想看看这条通路是如何被发现的。很巧，看到一篇“ZheMa”写的综述文章，直觉告诉我：他有可能是我实验室的师兄。就像去年看到一篇文章的作者中有“Hongyan Guo,Emory University”我一眼看出她就是小郭！话不多说，简而言之，这条通路可感知细胞质内的DNA，并且无需免疫细胞的传递或间接的调节，可直接影响IFN的表达，还有一点是该通路直接和机体的先天性免疫相关，和癌症、病毒感染、免疫性疾病等有直接关联。
至此还是有很多老问题：该通路如何发现的？为何没有更早的被挖掘？与免疫有何紧密关系？目前研究热点是什么？和药物研发有何关系？研究技术和方法有哪些？其中有哪些有趣的故事？还有哪些猜测没有被证实？等等。故事就是这样，若是对此一无所知，也就无法产生兴趣；若是对之一知半解，却又无用；唯有专注一段时间，才会触及奥妙的边缘，让你好奇万分。曾经公司内部的一门课“Career development”中CSO提及了读书的三境界，几次课都反复强调：
Understand the conclusion,without knowing the reason;--A book slaver
Understand the conclusion, knowingthe reason;
Understand the conclusion, knowingits limits;--A book owner
我感觉自己所追求的也是提高自己读书的境界，我不希望自己只是知道一些知识，听说过一些内容，目前我的阶段性目的是了解问题的背后和未来，希望自己能提出前沿的问题并给出解决方案。但也有一个限制：我只对自己感兴趣的言语、话题、新闻稍稍上点心，大多时候对文字免疫，无法刺激我的神经，在我的脑中未曾留下片刻足迹。
——题记
过去的十多年人们围绕细胞质DNA与免疫刺激因子开展了许多创新性的研究，自2008年起诸多的DNA sensor被相继发现，并且进一步解释了DNA诱导I型IFN的表达、抗病毒效应以及自身免疫等现象的分子机制。至今人们已发现十余种DNSsensor，在他们的下游有一个关键的分子——STING，作为枢纽向下继续传递信号。容我徐徐道来其中的细节。
Immune Sensing of DNA
先天免疫，换句话说就是本身具有的免疫，与针对特异抗原产生特异性的抗体和活化T细胞有着明显的不同，他能过通过某种方式直接识别“外来物”并活化免疫系统对之加以攻击。与军事上的应急处理方式类似，未及中央给予回复便可适时反击。很早以前人们发现了先天免疫会利用一种天生的受体，俗称模式识别受体，这些受体可以识别一些非自我、来自病原生物的产物或带有自我伤害性质的宿主分子，之后激活自身免疫系统来清除外来物或者对自身有损害的分子。最早被发现的、也是被研究最为透彻的就是Toll样受体一样啊！如何区分敌我呢？随即这个新发现好比一块石头，“噗通”一声跳入平静的水面，人们感知到先天性免疫即将发生革命性的转变。接下来人们陆续揭示了细胞内DNAsensor，相继阐明介导免疫系统应答的分子机制，发现DNA可以诱导I型IFN的表达、炎症因子的释放，引发自噬、凋亡、焦亡等过程。[1]
那么问题来了：细胞质中的DNA 哪里来的？与“良民”有何区别？细胞如何识别？
其实对于外源DNA能刺激机体免疫水平的了解早在1960s就开始，稍稍想象一下当时发现DNA是遗传物质不久，当时的研究手段不乏排除法，比如发现病毒能诱导细胞产生IFNs后开始研究直接的刺激因子，是蛋白组分呢？DNA还是RNA？等等，A. Isaacs等人早期的探索揭示了外源的核酸可以诱导IFN的表达。[2]现在我们会说真核细胞中的DNA长居于细胞核中，因此会认为不老实的DNA是破坏分子，若DNA悄然来到细胞质、内体等地方，细胞绝对不允许。。由此看你来，细胞核获得了胞内免疫的某种特权，内部的DNA被视为良民，而细胞核以外的DNA则会被格杀勿论，被贴上DNA PAMPs或DNA DAMPs的标签。其实，外源的DNA确实有些不一样，比如无甲基化的CpG DNA模序常见于病原体的基因组、富含AT环结构的单链DNA等。
谈到细胞如何识别核酸就会让人想到OAS和cGAS、 TLR和STING。我想这里主要的发现依然是来自人们对病毒的研究，病毒来源的核酸会被一些特别的模序识别或感知，比如未经修饰的完全互补的5’三磷酸的RNA可活化细胞内的RNA解旋酶RIG-I、长链的RNA可被MDA5检测，而TLRs可以识别多种RNA和DNA分子。[3]
The three mammalian RLRs are superfamily 2 DExD/H-box RNA helicases[3]
OAS和cGAS的名称看似姊妹，实际上二者也有许多共性，但分工不同。简单来说，OAS可以感知细胞质中的RNA，而cGAS可感知细胞质中的DNA。其中cGAS通过典型的PRR的通路被激活，通过STING上调IFNs的表达，进而诱发抗病毒的活性；与之不同，OAS和下游的RNase L一同触发更为激烈、及时的反应来降解病毒的RNA，抑制病毒蛋白的翻译。OAS和cGAS在结构上有类似的折叠，或许进化与同一起点；二者结合双链核酸的方式类似；都产生2’5’相的磷酸二酯键；二者实属同一个大的家族，称为核苷酸转移酶。
The OAS-RNase L system
正如其名，OAS可以产生2’5’相连的寡聚腺苷酸，在人源细胞中存在四个同源的蛋白：OAS1、OAS2、OAS3和OASL，前三者可以产生2’-5’A，OASL缺乏这种能力，但有报道显示他可以通过RIG-I发挥抗病毒的功能。之后2’-5’A作为第二信使会通过诱导RNase L二聚化并使其活化。RNase L是细胞质内的一种核酸酶，又称RibonucleaseL、ribonuclease 4 或OAS-dependentribonuclease，可直接切割细胞内源的或病毒的RNA，进而抑制病毒的复制；RNaseL也是一种可被IFN诱导表达的一种蛋白，可以通过MDA5诱导IFN的表达，上调OAS的表达后来增强抗病毒的活性。细胞十分危急时刻，也会选择宁为玉碎不为瓦全的手段摧毁病毒的感染。当细胞内病毒的RNA过量时，RNase L的长时间活化也会破坏细胞本身的正常运转，抑制细胞蛋白的表达、诱发凋亡，阻止病毒的进一步增殖。
RNase L activation pathway
TLR9
早期人们发现细菌的DNA可以活化哺乳类动物的免疫细胞，主要由于细菌的DNA存在未经修饰的CpG，而哺乳类细胞中的CpG出现的频率比较低且多数被甲基化，正因如此，细菌来源的CpG常用作疫苗治疗癌症时的佐剂。在2000年，Shizuo Akira的团队揭示了这个感知细菌DNA的受体，通过序列比对分析他们发现一个基因与之前的TLR基因比较类似，故按序命名为TLR9。他们利用BLAST、DNA探针杂交以及基因敲除的小鼠在体内和体外确认了TLR9感知细菌DNA的作用。[4]现在人们已知细菌的、病毒来源的DNA均可以被浆类树突细胞、单核细胞、NK细胞和B细胞等内定位在内溶酶体中的TLR-9识别。
CpG on one DNA strand , and complementary C-Gbase-paring on two DNA strands .
发现了识别外源DNA的受体，人们瞬间感觉疑惑顿开，希望尽快揭示其中隐藏的分子机制。过了五年左右，有人发现TLR9缺失的细胞被外源DNA刺激后依然具有抗病毒免疫的能力。[5]后续有人提出一种解释：富含AT序列的DNA在细胞质中经RNA Pol III转录后产生的RNA可以激活RIG-I通路，进而活化免疫系统。然而大多数DNA分子，包括微生物来源的DNA，并不能起始RNA pol III介导的转录。这也就是意味着一定存在某种和TLR9不同的通路，能够感知细胞质中的DNA。
STING
究竟会是什么呢？如何寻找呢？确实非常的吸引人，一个应该是广泛存在的通路，还和先天免疫相关，我想没有人愿意在这里放慢脚步，这也许可以看成是科学的自我进化。没过多久，三个课题组先后报道了发现新的DNA sensor可以介导DNA引起的免疫波动：一篇的切入点时寻找诱导IFN表达的蛋白，他们选用了一个融合了IFN-β启动子的报告基因，筛选了5500个人源的和9000个鼠源的基因，后来发现了STING；[6]一篇的入手处是寻找调节NFκB和IRF3活性的蛋白，在刺激IFN表达的上游通路中，也是用过表达文库的实验进行筛选，使用的报告基因是融合了IRF3响应的特异序列，前后筛选了约200,000个克隆，后来发现了MITA；[7]另一篇利用鼠骨髓来源的巨噬细胞的cDNA文库进行筛选，报告基因也是IFN-β-Luciferase，希望找到能够上调IFN-β的蛋白。后来他们发现了ERIS，并揭示该分子的二聚化对免疫系统活化至关重要。[8]再后来人们发现，这三个蛋白其实是同一个，最终统称为STING。
到此，人们只是打开了一扇门，看到了细胞识别细胞质中的RNA和DNA的多种方式，应该还有更多种，亟待被科学家解开他们的面纱。没用几年的时间，人们先后发现了DNA sensor-STING-TBK1-IRF3-TypeI IFNs的通路中的关键成员，DNA sensor也接连走到人们面前，比如DAI、DHX9、DDX41等等，可是这些发现还是暴风雨来临的前奏，因为缺失任何一个DNAsensor都无法向缺失STING那样阻断DNA诱导的免疫活化。这又一次表明，在这些DNA sensor之外，还存在着一种或更多的DNAsensor能够将信号传递给STING。那么，这又会是谁姗姗来迟呢？
Cytosolic RNA Sensing and Intracellular DNA Sensorspost virus infection[3]
The cGAS-STING axis
2009年到2011年间，人们陆续发现细菌里的第二信使环鸟苷二磷酸可激活STING依赖的免疫系统，诱导IFNs的表达。2011年8月，RussellE. Vance等人用同位素标记的方法发现在动物细胞中STING本身是可以直接感知c-di-GMP的DNA sensor，并且初步用缺失的方法发现几处重要的位点，比如STINGR231A则无法继续响应c-di-GMP的刺激。[9]后续的晶体解析工作显示c-di-GMP结合在STING经二聚化在C端形成的V型口袋。不过当时人们还不确定STING是否可以直接与DNA结合。
到2013年，陈志坚教授的团队在Science期刊连续发表两篇重量级文章报道环鸟苷酸-腺苷酸作为第二信使可直接活化STING，[10]并且发现cGAMP上游关键合成酶——cGAS。[11]他们的思路和实验设计都比较巧妙：一方面抓住细胞质DNA激活STING通路时序列不依赖的过程，表明存在某种更普遍的分子机制；一方面他们提取了细胞的亚组分，这和当年利用排除法确认DNA是遗传物质的过程类似，首先要确认是哪种组分是激活STING的关键。首先选用一株易通过STING诱导表达IFN的细胞系，经shRNA干扰STING的表达，在过转DNA激活STING上游通路的某种因子，再与经perfringolysin O穿孔的人源单核细胞系THP1或鼠源巨噬细胞Raw264.7共孵育，若转染的DNA刺激了STING上游因子的活化，所提取的细胞提取物会将信号传递到THP1或Raw264.7中的STING，进而引发IRF3的活化，也就是会产生二聚化的IRF3。
Illustration of an activity assay forcellular factors that activa4te the STING pathway[10]
实验中选用的DNA包括刺激IFN表达的DNA、poly[dA:dT]、GC-rich的50bp长的dsDNA、poly[dI:dC]和herring testis DNA ，结果显示这些不同类的DNA均可诱导IRF3的活化，表明STING的活化对转染的DNA并没有选择性；接下来验证STING上游的因子是否是蛋白，作者利用95˚C热灭活的方法去除蛋白的影响，很快，人们惊奇的发现了二聚化的IRF3——表明STING上游的活化因子并非蛋白，比较而言是核酸的可能性更大，或者说可以兴奋的猜测就是DNA还是RNA！显然，要立刻验证究竟是谁，这时核酸酶、蛋白酶K、DNA酶和RNA结构被派上来试探一下，Waoooh，结果清晰的显示了STING上游活化的因子竟然是DNA！
做到这里已经是上一个台阶，需要通过不同的对照组反复验证，比如其他细胞提取物如何、是否通过RNA pol III、是否依赖RIG-I、是否仅通过STING等等，结果没有再出现意外的发现。接下来作者没有停下脚步，而是继续寻找STING上游的这个“DNA”活化分子到底是什么结构，毕竟DNA的情况过于复杂：多长？多短？二级结构？有何特征？不过前不久发现的c-di-GMP到是给了他们一些提示，可是利用色谱结合LC/MS的方法并未发现所测试的细胞中存在c-di-GMP，不过获得的一些线索显示细胞提取物种含有某种c-di-GMP和c-di-AMP杂交的结构——也就是c-GMP-AMP！
Expected fragmentation patterns of cGAMP[10]
看到这里好比身临其境，这是多么让人激动的结构啊，过了午夜也无法停下来，希望看到后面的故事！
暂且不说这个小分子的结构多么简单、精美，之前并没有工作报道真核细胞中存在cGAMP的分子，这将引来多少创新的工作，定会吸引一批有干劲的年轻人，若是得以揭示cGAMP在真核细胞中也是一种第二信使，那后续的工作就更多了。闲话不多说，作者继续验证cGAMP能否直接活化STING，是否还存在其他可能的DNA分子？接下来Chemists上场了，直接合成cGAMP再刺激细胞，检测IRF3和IFN的活化水平。期间还发现HEK293T内的STING的表达量过低，不适合用分析cGAMP的效果，相比而言L929、THP1和巨噬细胞等更为合适，结果清晰明显。文中涉及了三个实验：1，过表达或稳转STING；2，KnockdownSTING的表达；3，分析STING是否可以与cGAMP直接结合。结果都显示cGAMP可以作为细胞质DNA激活免疫系统过程中的内源第二信使。[10]
Cyclic dinucleotides in prokaryotes and metazoans [13]
不难猜测，作者一定在开展验证实验的同时也在寻找cGAMP上游的分子，这个难度应该小了不少，并且作者在发现cGAMP的同时在体外实验已经看到ATP和GTP的必要性。在未找到相应的合成酶之前，作者将之称为cGAS。余下的过程就是将L929细胞中的亚组分用不同的方法分别纯化，选用4步色谱技术分离，还有一组用生物素标记的寡聚DNA进行亲和层析。分析收集到的不同分离组分对STING的激活能力，再联合定量质谱分析，发现3个蛋白经三种路线纯化后依然存在，比对序列后发现一个与人源OAS1催化结构域同源的蛋白——他就是cGAS。后续的结果验证了cGAS定位在细胞之中、可以起始I型IFN的表达、是转染DNA或感染病毒后诱导IFNβ过程中必要的成员、体外酶学试验也直接显示cGAS可以结合DNA并且能催化ATP和GTP合成cGAMP；此外，作者还证实过表达其他DNA sensors时不会产生cGAMP，Knockdown以后也不会抑制cGAMP的产生等等。
Purification of cGAS and itsidentification by quantitative mass spectrometry[11]
到此，cGAS-cGAMP-STING通路闪耀登场，时值2013年伊始，那个时候我还在读研二。没想到几年过去了，现在才发现这条和自己毫不相干的通路。现在看起来简单虽说只是简单的几篇文章，可是他们的重要性是里程碑性的，好比同一时期的几篇文章阐述了CRISPR/Cas9的工作机制。到现在已经过去两年多，该领域的成果如雨后春笋般展露，可见她的重要性。
从STING到DNA sensors 、从OAS到cGAS、从c-di-GMP到cGAMP，这段路走的并非漫长，若是站在当时的情形之下，我想人们更关注的还是这条通路接下来能带来哪些新奇。首次发现哺乳动物细胞中的cGAS和cGAMP，这就有很多工作可以开展；首次发现STING可以直接结合cGAMP，又给人们许多遐想的空间；STING和IFN和免疫，就会想到该通路在肿瘤、病毒、免疫等疾病中的角色；当然，要是能直接了解她们的晶体结构将会直接、便捷的提供重要的信息。
如此新奇的发现，着实鼓舞人心！我想该是时候回头看看TLR的过去和现在了。
OAS1–RNase L and cGAS–STING axes in innate immunesignalling and antiviral defence[13]
TJ Pharmaron
Sep. 07, 2016 Wed
Reference
1. Paludan, S.R.and A.G. Bowie, Immune sensing of DNA.Immunity, 2013. 38: p. 870-80.
2. Isaacs,A., R.A. Cox, and Z. Rotem, FOREIGNNUCLEIC ACIDS AS THE STIMULUS TO MAKE INTERFERON ☆.Lancet, 1963. 282: p. 113–116.
3. Goubau,D., S. Deddouche, and C. Reis e Sousa, Cytosolicsensing of viruses. Immunity, 2013. 38:p. 855-69.
4. Hemmi,H., et al., A Toll-like receptorrecognizes bacterial DNA. Nature, 2000. 408: p. 740-5.
5. Yasuda,K., et al., Endosomal translocation ofvertebrate DNA activates dendritic cells via TLR9-dependent and -independentpathways. J Immunol, 2005. 174:p. 6129-36.
6. Ishikawa,H. and G.N. Barber, STING is anendoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling.Nature, 2008. 455: p. 674-678.
7. Zhong,B., et al., The adaptor protein MITAlinks virus-sensing receptors to IRF3 transcription factor activation.Immunity, 2008. 29: p. 538-50.
8. Sun,W., et al., ERIS, an endoplasmicreticulum IFN stimulator, activates innate immune signaling throughdimerization. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106: p. 8653-8.
9. Burdette,D.L., et al., STING is a direct innateimmune sensor of cyclic di-GMP. Nature, 2011. 478: p. 515-8.
10. Wu, J. and Z.J. Chen, CyclicGMP-AMP Is an Endogenous Second Messenger in Innate Immune Signaling byCytosolic DNA. Science, 2013. 339:p. 826-30.
11. Sun, L., et al., CyclicGMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferonpathway. Science, 2013. 339:p. 786-791.
12. Thomsen, M.K., et al., Lackof immunological DNA sensing in hepatocytes facilitates hepatitis B virusinfection. Hepatology, 2016. 64:p. 746-59.
13. Hornung, V., et al., OASproteins and cGAS: unifying concepts in sensing and responding to cytosolicnucleic acids. Nat Rev Immunol, 2014. 14:p. 521-8.
