枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果。2005版《中国药典》一部采用高效液相色谱法,以辛弗林为对照测定其含量。文献报道的常用的含量方法为高效液相色谱法和薄层扫描法。
一、 高效液相色谱法
2005版《中国药典》枳实含量测定项下:
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-磷酸二氢钾水溶液(取磷酸二氢钾0.6g,十二烷基磺酸钠1.0g,冰醋酸2ml,加水溶解并稀释至1000ml)(50:50)为流动相,检测波长为275nm。理论板数按辛弗林峰计算应不低于2000。
供试品溶液的制备:取本品中粉约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加甲醇50ml,称定重量,加热回流1.5小时,放冷,再称定重量,用甲醇溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液10ml,蒸干,残渣加水10ml使溶解,摇匀,通过聚酰胺柱(60~90目,2.5g,内径1.5cm,干法装柱),以水25ml洗脱,收集洗脱液,转移至25ml量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得。
文献报道的HPLC法,其实验仪器和色谱条件等总结如下:
实验仪器:1100高效液相色谱系统,包括四元梯度泵、手动进样器、二极管阵列检测器、色谱工作站(美国Agilent公司);岛津LC高效液相色谱仪;美国W aters高效液相色谱仪
色谱条件:①色谱柱为Hypersil ODS C18 (100mm 4.6mm,5μm),流动相为甲醇-水(含0.1%磷酸、0.1%十二烷基磺酸钠)(43:57);检测波长为275nm;柱温为40℃;流速为1.0ml/min;②色谱柱Zobax Ex tend-C18 (4.6×250mm,5μm)。流动相为甲醇:水(52:48),内含0.1% 十二烷基磺酸钠和0.5%磷酸;检测波长:275nm:流速:0.9mL/min;柱温:35℃;③色谱柱为Resolve C18不锈钢柱,5μm,4.6×150mm。流动相为甲醇-水(1:1),含3.5%戊烷磺酸钠,0.1%冰醋酸;流速0.8ml/min;检测波长275nm;④色谱柱:4.6mm×200mm内填10μm ypersil C18(大连依利特公司);流动相:甲醇-水(水中含0.02% H3PO4及0.1%十二烷基磺酸钠, 5:2);检测波长:224nm;柱温:室温;流量:0.6ml/min。⑤色谱柱:ZORBAX ODS (Agilent 4.6mm×150mm,5μm);预柱:ZORBAX ODS(Agilent 4.6mm×12.5mm,5μm);流动相:乙腈-水-磷酸-十二烷基硫酸钠( 32:68:0.1:0.1),其中每升溶液中加入5 mmol二乙胺改良剂;柱温:35℃;流速:1.0ml/min;检测波长:224nm;
供试品溶液的制备:一般用甲醇超声提取,也有用磷酸超声提取的。
二、薄层扫描法
国荣等采用薄层扫描法测定了酸橙枳实中的辛弗林的含量。采用岛津CS-900薄层扫描仪。层析条件:硅胶G板;展开剂为氯仿-甲醇-甲酸-水(6:2:1.4:0.1);显色剂为取醋酸镉0.1g,以40%醋酸溶液20ml溶解,加丙酮至10ml;临用时用此溶液配制0.2%茚三酮溶液。扫描条件:双波长反射线形扫描,测定波长510nm,参比波长700nm。药材用甲醇回流提取。